Cell | RNA结合蛋白TgPRO介导弓形虫代谢与氧化还原适应

撰文 | 阿童木

生物体在不断增殖的过程中，不仅需要获得足够的营养物质，还必须处理随细胞密度升高而增加的代谢压力。营养物质耗竭、代谢废物积累、氧利用变化以及氧化应激，都可能使原本支持快速增殖的代谢网络成为生长限制因素。 细菌和酵母可以通过RpoS、Msn2/4等调控系统调整应激相关基因表达，哺乳动物细胞则利用HIF1、NRF2和IRP1/2等因子应对缺氧、氧化应激和铁限制【1,2】。 然而，对于疟原虫和弓形虫等顶复门寄生虫而言，其基因组中缺少许多经典代谢应激调控因子的同源物，因此这些胞内寄生虫如何根据环境变化主动调整代谢基因表达仍不清楚。

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）为研究这一问题提供了合适模型。急性感染过程中，速殖子可以在宿主细胞内持续复制；进入慢性阶段后，缓殖子则可在神经元或肌肉细胞中形成含有数百个寄生虫的组织囊体【3】。随着寄生虫数量不断增加，高密度本身就可能成为一种重要的代谢压力。

近日，Whitehead Institute的 Sebastian Lourido 团队等在 Cell 在线发表了题为 Convergent evolution of metabolic regulation governs redox adaptation in Toxoplasma 的研究文章。通过CRISPR筛选、RNA互作分析、转录组、蛋白质组和代谢组学等方法， 发现弓形虫在高密度生长过程中对NAD(P)+稳态产生更高需求，并鉴定出一个此前未知的RNA结合蛋白TgPRO。TgPRO通过稳定一组代谢相关mRNA，协调Fe-S簇形成、线粒体功能和中央碳代谢，从而帮助寄生虫限制氧化应激并适应高密度生长 。

研究人员首先比较了弓形虫在低感染密度和高感染密度条件下的基因需求。全基因组CRISPR筛选鉴定出31个在高密度条件下更加重要的基因，其中最突出的共同特征来自NAD(P)+生物合成通路。该通路5个相关基因中的4个达到筛选标准，提示 高密度生长对NAD(P)+的合成与再循环需求更高 。

进一步敲除 NAD(P)+生物合成相关的酶 编码基因NMNAT或NAPRT后，两类突变体在低密度条件下与野生型寄生虫竞争时没有明显缺陷，但在高密度条件下迅速失去竞争优势。补充 烟酰胺 则能够明显恢复其适应性，说明 高密度生长确实提高了寄生虫对NAD+来源的需求 。同时，葡萄糖转运蛋白TgGT1和hexokinase也出现在相关筛选中，提示 高密度环境同时改变了寄生虫对碳代谢的依赖 。

为了寻找这一代谢适应过程的调控因子，研究人员进一步针对候选基因进行了定向筛选。其中，一个此前未表征的基因TGGT1_202900表现出显著的高密度生长缺陷，并可被 烟酰胺 部分缓解。作者将这一蛋白命名为TgPRO，即T. gondii parasite response to oxidation。TgPRO含有两个保守的C3H型锌指结构域，这类结构通常参与RNA结合。突变两个C3H结构域中的关键残基后，即使通过增加基因拷贝或过表达恢复蛋白丰度，也无法恢复寄生虫的高密度生长能力。 因此， TgPRO的RNA结合功能对于弓形虫适应高密度生长至关重要 。

随后，研究人员通过RIP-seq鉴定出89个与TgPRO显著结合的转录本。值得注意的是，NAD(P)+合成酶本身并不是TgPRO的直接RNA靶标，但其结合的转录本覆盖多个与氧化还原稳态相关的代谢模块，包括葡萄糖转运蛋白TgGT1、乳酸转运蛋白、PDK以及参与泛酸和辅酶A合成的PBAL。此外，TgPRO还结合多种参与铁、锌稳态以及Fe-S簇形成的转录本，并能 结合自身转录本，提示 可能 存在反馈调控。

转录组和蛋白质组分析进一步表明，TgPRO能够维持其中一部分靶转录本及其编码蛋白的丰度。阻断新RNA合成后，ISCU和ZFT等TgPRO靶RNA在正常寄生虫中具有较高稳定性，而TgPRO RNA结合功能受损后，其稳定性明显下降。 这些结果表明， TgPRO可通过转录后机制提高其中一部分靶mRNA的稳定性，从而维持相关代谢蛋白的表达。

由于多个TgPRO靶标参与铁稳态和Fe-S簇形成，作者进一步考察了这一调控模块的功能。TgPRO缺失使寄生虫对铁螯合剂更加敏感，而补充铁则可以明显恢复其高密度生长缺陷。与此同时， TgPRO功能缺失导致线粒体备用呼吸能力下降，提示电子传递链在代谢需求增加时提高电子流的能力受限；这一缺陷可通过补铁得到恢复。此外，在线粒体中表达NADH氧化酶LbNOX可显著改善TgPRO缺失寄生虫在高密度条件下的适应性，而胞质定位的LbNOX则没有相同效果，提示 TgPRO缺失导致的生长缺陷至少部分与线粒体NAD+/NADH平衡受损有关 。

代谢组学进一步显示，TgPRO失活会改变中央碳代谢，导致磷酸戊糖途径多个中间产物明显降低，葡萄糖来源的碳更多偏向糖酵解。同时，TCA循环中出现 顺乌头酸 积累等变化，提示Fe-S依赖的 乌头酸酶 以及线粒体代谢受到影响。由于氧化型磷酸戊糖途径是细胞产生NADPH的重要来源，这些改变意味着 TgPRO缺失会削弱寄生虫维持还原力和清除活性氧的能力。

与此一致，TgPRO敲低后寄生虫ROS水平升高，而且这一差异在高密度条件下进一步放大。弓形虫通常在约21% O₂的大气氧条件下培养，而动物组织中的氧浓度通常明显更低。当 作者 将培养氧浓度降至1%时，TgPRO缺失导致的ROS差异基本消失，其高密度生长缺陷也得到部分缓解。这表明 TgPRO所应对的一个重要压力与氧化还原失衡有关，同时也提示常规大气氧培养条件可能放大寄生虫对部分氧化还原稳态通路的需求。

不过，TgPRO并非只在体外高氧环境中发挥作用。研究人员在更容易形成慢性感染的ME49弓形虫中敲除TgPRO后发现，小鼠脑内形成的组织囊体数量并没有明显减少，但囊体体积显著变小， 说明 TgPRO对于慢性阶段组织囊体的正常生长具有重要作用 。

最后，作者以Fe-S簇组装蛋白ISCU为模型解析TgPRO的调控机制。正常寄生虫由21% O2转移到低氧环境后，ISCU mRNA迅速下降，而TgPRO功能缺失时ISCU始终维持较低表达。当研究人员将ISCU自身的3′ UTR替换成不受TgPRO调控的CDPK3 3′ UTR后，ISCU对TgPRO和氧浓度的依赖均明显减弱，TgPRO也不再有效结合该转录本。反过来，将ISCU 3′ UTR连接到荧光报告基因后，又能够赋予报告基因TgPRO依赖性。因此， 对于ISCU而言，其3′ UTR既是TgPRO调控所必需的，也足以赋予转录本TgPRO依赖性 。

总体而言，这项研究 将寄生虫密度、NAD(P)+稳态、Fe-S簇形成、中央碳代谢以及氧化应激连接到同一调控框架之中，并首次在顶复门寄生虫中定义了一个环境响应性的专门代谢基因调控因子。不过，TgPRO究竟直接感知氧、ROS、铁还是Fe-S簇状态，目前仍不清楚；其RNA识别序列以及慢性阶段是否具有不同的靶转录本，也有待进一步解析 。

制版人： 十一

参考文献

1. Stewart-Ornstein, J . et al. Msn2 coordinates a stoichiometric gene expression program .Curr. Biol.2013; 23:2336-2345 .

2. Missiaen, R. et al. HIF: a master regulator of nutrient availability and metabolic crosstalk in the tumor microenvironment .EMBO J.2023; 42, e112067 .

3. Chou, E.S. et al. A high parasite density environment induces transcriptional changes and cell death in Plasmodium falciparum blood stages .FEBS J.2018; 285:848-870

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